最近在qPCR儀的使用過程中
經(jīng)常會有小伙伴有一些疑問
1 、我的實驗數(shù)據(jù)是否可靠？
2 、實驗結(jié)束了，
我應(yīng)該關(guān)注哪些數(shù)據(jù)和圖像，
才符合要求？
3 、數(shù)據(jù)和曲線有什么關(guān)系，
兩個不同步，
數(shù)據(jù)能不能用？
等等問題。。。。
那我們接下來就跟小伙伴們一起探討一下吧。
常規(guī)我們需要關(guān)注的有
01 Ct值
首當其沖的就是CT值：Ct值，也稱為循環(huán)閾值，它表示樣品反應(yīng)超過熒光閾值的循環(huán)數(shù)，表明目標核酸的檢測結(jié)果。Ct值越低表示目標序列初始量越大。影響Ct值大小的因素有很多，實驗過程中需要控制這些因素保證Ct值的準確性和真實性。Delta-Delta Cq這種標準化的方法，通過引入內(nèi)參基因，可以將生物反饋變化帶來的目標序列真實濃度變化與技術(shù)操作問題區(qū)分開。
Tips：Ct值的不同術(shù)語
Ct – cycle threshold/threshold cycle（循環(huán)閾值）
Cp – crossing point（交叉點）
TOP – take-off point（起點）
Cq – quantification cycle（量化循環(huán)數(shù)）
以上這些詞都是表示的Ct值，只是名稱不同而已。為了標準化qPCR命名法，MIQE（minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments）指南建議使用Cq值。）
通常情況下，我們依據(jù)以下標準來評估 Cq 值的結(jié)果：
? 優(yōu)秀：內(nèi)參基因的 Cq 值在 14-18 之間，目的基因的 Cq 值也應(yīng)在 14-18 之間。
? 良好：內(nèi)參基因的 Cq 值在 12-20 之間，而目的基因的 Cq 值應(yīng)在 14-32 之間。
? 一般：內(nèi)參基因的 Cq 值在 10-22 之間，同時目的基因的 Cq 值則應(yīng)在 14-35 之間。然而，若目的基因的 Cq 值超過 35，雖然仍然可以使用這些數(shù)據(jù)，但可能會對實驗結(jié)果的準確性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致結(jié)果的偏差較大。所以，若發(fā)現(xiàn) Cq 值偏高，建議重新進行實驗以確保結(jié)果的準確性。
02 熔解曲線
除了我們上面說到的Cq值以外，我們常規(guī)還要關(guān)注的一個東西，那就是熔解曲線。為了保證實驗結(jié)果準確可靠。
我們在檢查熔解曲線時，就需要關(guān)注以下幾個方面：
? 熔點(TM值)：熔點應(yīng)該位于75-90℃之間，這是一個比較合適的范圍。
? 峰型：峰型應(yīng)該是單峰的，不應(yīng)該存在任何雜峰。
? 峰距：在理想情況下，峰距應(yīng)該在5個TM單位內(nèi)，這樣可以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。
（圖片來自Archimed X4 實驗數(shù)據(jù)）
熔解曲線的解讀：根據(jù)我們的引物設(shè)計原則，擴增產(chǎn)物長度在80-300bp范圍，那么熔解溫度應(yīng)該是在80℃-90℃之間。
所以，如果在80℃-90℃之間出現(xiàn)唯一主峰，說明熒光定量PCR完美；如果在80℃-90℃之間出現(xiàn)主峰，80℃以下出現(xiàn)雜峰，基本考慮引物二聚體，可嘗試提高退火溫度解決；如果在80℃-90℃之間出現(xiàn)主峰，溫度上升又出現(xiàn)雜峰，基本上考慮有DNA污染，需要在實驗初始階段去除DNA。
03 擴增曲線
一個標準的擴增曲線，曲線形態(tài)應(yīng)該接近S型。
（圖片來自Archimed X4 實驗數(shù)據(jù)）
? 平臺期：需要觀察曲線是否有明顯的平臺期。平臺期的清晰度對于結(jié)果的準確性和可靠性至關(guān)重要。濃度較低的情況下，可能沒有明顯的平臺期。
? 二次擴增：應(yīng)觀察曲線是否出現(xiàn)二次抬頭的情況，正常曲線不應(yīng)該在擴增過程中再次上升。若出現(xiàn)二次擴增，則會影響我們對擴增過程的準確理解，因此需要特別注意。
Tips：擴增曲線常識
(1) 擴增曲線：平滑的S型曲線。
(2) Ct值在15-35范圍內(nèi)。
(3) 沒有平臺期數(shù)據(jù)也可用。
(4) 基線通常在3-15個循環(huán)。
(5) Ct值超過35需要判斷數(shù)據(jù)的可靠性。
(6) 技術(shù)性重復(fù)3個，重復(fù)的Cq值的差異不超過0.5。
04 標準曲線
上面三個點基本上已經(jīng)能夠滿足我們常規(guī)判定qPCR實驗數(shù)據(jù)是否符合我們要求了，但還有額外的一個東西，可能有些小伙伴會遇到，那就是:標準曲線。 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用上，很多小伙伴都會用到標準曲線的構(gòu)建。
標準曲線的構(gòu)建過程大致分為：
(1) 樣本準備: 選擇一系列已知濃度的核酸樣本(如DNA或RNA)，這些樣本的濃度應(yīng)在實驗預(yù)期的濃度范圍內(nèi)，并且盡可能接近將用于實驗的樣本。
(2) qPCR擴增：對這些不同濃度的樣本進行qPCR擴增，記錄每個樣本的擴增過程。
(3)數(shù)據(jù)分析: 以初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為X軸，以Cq值為Y軸，繪制結(jié)果曲線。這條曲線就是qPCR的標準曲線。
（圖片來自Archimed X4 實驗數(shù)據(jù)）
標準曲線的好與壞判定標準：
(1) 線性的標準曲線(R2＞0.980或R大于|-0.990|)。
(2) 擴增效率(90~110%)。
(3) 斜率范圍 -3.58~-3.10。
(4) 至少有3個技術(shù)性重復(fù)。
通過我們上述四點
基本上能滿足我們
對于實驗數(shù)據(jù)的可靠性判定了
當然
一次優(yōu)秀的實驗結(jié)果呈現(xiàn)
除了實驗操作的準確無誤外
還取決于優(yōu)秀實驗設(shè)備的選擇
比如
鯤鵬基因Archimed系列qPCR儀
Archimed 系列熒光定量PCR儀是鯤鵬基因汲取定量PCR技術(shù)發(fā)展之精華，由國際化資深技術(shù)團隊匠心打造的全球首款時間分辨實時熒光定PCR系統(tǒng)。基于菲涅爾透鏡的新型光路系統(tǒng)、專利的時間分辨信號采集技術(shù)及獨特的控溫技術(shù)，使Archimed具備更高的檢測靈敏度、更卓越的溫控準確性和均一性、更便捷的操作流程，以及更全面的分析功能。同時，基于全球視野的產(chǎn)品設(shè)計理念及制造工藝，賦予Archimed國際水準的優(yōu)異品質(zhì)。
