在進行PCR實驗的過程中，你是否曾經(jīng)遇到過這樣的困境：
你精心設(shè)計了多對引物，然而無論你如何努力進行PCR反應(yīng)，總是無法避免出現(xiàn)一些非特異性的雜帶。這讓你感到非常沮喪，甚至開始懷疑自己的實驗技能。
項目的進度非常緊張，你沒有足夠的時間去仔細優(yōu)化反應(yīng)條件，而你的老板又在催促你盡快將PCR產(chǎn)物做出來。
你需要在單一的反應(yīng)管中實現(xiàn)對多個靶標的檢測，但無論怎樣調(diào)整反應(yīng)體系，總是會有一些交叉反應(yīng)發(fā)生，影響實驗結(jié)果的準確性。
在這種情況下，你可以考慮采用一種名為降落PCR（Touchdown PCR）的技術(shù)，這是一種快速且便捷的方法，可以幫助你獲得更好的實驗結(jié)果。降落PCR是由Don等人在1991年基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)明的一種改進技術(shù)。該技術(shù)的核心在于對PCR反應(yīng)程序中不同循環(huán)階段的退火溫度進行逐步遞減的調(diào)整，從而提高反應(yīng)的特異性。
降落PCR的基本原理如下
在較高的退火溫度下，只有那些與引物序列高度匹配的正確模板才能有效地結(jié)合引物并進行PCR擴增。此時，引物與模板的結(jié)合效率相對較低，因此擴增效率整體也較低，但特異性較好。
在較低的退火溫度下，引物更容易與模板結(jié)合，結(jié)合效率較高，從而可以實現(xiàn)較高的擴增效率。然而，這也可能導(dǎo)致引物與錯誤的模板結(jié)合，從而降低反應(yīng)的特異性。
當反應(yīng)體系中存在較高濃度的正確模板和少量的錯誤模板時，引物與少量錯誤模板結(jié)合的概率會大大降低，從而提升最終產(chǎn)物的特異性。
圖 1 降落PCR原理示意圖
降落PCR技術(shù)的實施步驟如下
首先，你需要確定一個初始的退火溫度，這個溫度通常比你引物的理論退火溫度略高。然后，在PCR循環(huán)的早期階段，使用這個較高的退火溫度進行幾個循環(huán)，以確保只有最匹配的模板能夠被擴增。接下來，每完成幾個循環(huán)，退火溫度就降低一點，通常降低0.5到1攝氏度。這個過程會持續(xù)到你設(shè)定的最低退火溫度，或者直到你認為已經(jīng)足夠富集正確模板為止。通過這種方式，降落PCR能夠有效地減少非特異性擴增，同時增加特異性擴增產(chǎn)物的量。
圖 2 降落PCR實驗效果
值得注意的是，降落PCR并不總是解決所有PCR問題的萬能鑰匙。在某些情況下，可能需要結(jié)合其他技術(shù)，如巢式PCR或使用特異性更高的引物設(shè)計，來進一步提高實驗的特異性和靈敏度。此外，降落PCR的參數(shù)需要根據(jù)具體的實驗條件進行優(yōu)化，包括退火溫度的起始值、降低的幅度以及降低的速率等。通過細致的實驗設(shè)計和優(yōu)化，降落PCR技術(shù)可以成為你實驗工具箱中的一個強大工具，幫助你克服PCR實驗中的難題。
ROCGENE解決方案
鯤鵬基因的全線PCR儀器（含熒光定量PCR儀、智能梯度PCR儀）均含有touchdown PCR的設(shè)置功能，可以助力用戶更好的完成PCR實驗。
以鯤鵬基因經(jīng)典的Archimed系列熒光定量PCR儀為例，設(shè)置某品牌含有降落程序的手足口試劑反應(yīng)程序，操作如下：
當然，優(yōu)異的熒光定量PCR儀需要兼容降落PCR功能，穩(wěn)定的結(jié)果取決于我們試劑性能和設(shè)備的選擇，就像我們鯤鵬基因的Archimed系列QPCR儀。
Archimed 系列熒光定量PCR儀是鯤鵬基因汲取定量PCR技術(shù)發(fā)展之精華，由國際化資深技術(shù)團隊匠心打造的全球首款時間分辨實時熒光定PCR系統(tǒng)?；诜颇鶢柾哥R的新型光路系統(tǒng)、專利的時間分辨信號采集技術(shù)及獨特的控溫技術(shù)，使Archimed具備更高的檢測靈敏度、更卓越的溫控準確性和均一性、更便捷的操作流程，以及更全面的分析功能。同時，基于全球視野的產(chǎn)品設(shè)計理念及制造工藝，賦予Archimed國際水準的優(yōu)異品質(zhì)。