相對定量實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因如何抉擇？
相對定量適用于大多數(shù)基因表達(dá)研究，可分析校準(zhǔn)（正常）樣本和一個或多個實(shí)驗(yàn)樣本 中目的基因表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)。采用該方法無需精確測定拷貝數(shù)，而是關(guān)注目的基因的 相對表達(dá)量的變化。ΔΔCt 法是一種非常普遍的相對定量分析方法，該方法能夠用于比較包 括校準(zhǔn)品 (如未處理或野生型樣本) 和標(biāo)準(zhǔn)品 (如管家基因表達(dá)) 在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)樣本的結(jié)果。采用該方法，可根據(jù)檢測樣本和校準(zhǔn)樣本中的標(biāo)準(zhǔn)品 (正常) 基因的 Cq 比較同樣兩個樣本 中的目的基因的 Ct ，其得出的 ΔΔCt 值可用于測定表達(dá)的倍數(shù)差異。
相對定量實(shí)驗(yàn)常用來:
比較基因在不同組織中的表達(dá)水平；
比較處理過的樣品和未處理過的樣品中基因的表達(dá)水平；
比較不同遺傳背景下感興趣基因的表達(dá)水平；
分析特定處理下基因隨時間的表達(dá)變化。
相對定量實(shí)驗(yàn)首先選擇合適的內(nèi)參基因是確保qPCR（實(shí)時定量PCR）實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA等，但具體選擇哪一個或多個內(nèi)參基因取決于實(shí)驗(yàn)條件、樣本類型和目標(biāo)基因表達(dá)水平的穩(wěn)定性。
01、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）
優(yōu)點(diǎn)
廣泛使用：GAPDH是qPCR實(shí)驗(yàn)中最常用的內(nèi)參基因之一，因其在大多數(shù)組織和細(xì)胞中表達(dá)相對穩(wěn)定。
適用性廣：在各種細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件下，GAPDH通常表現(xiàn)出較為一致的表達(dá)水平。
缺點(diǎn)
表達(dá)穩(wěn)定性問題：在某些情況下，如細(xì)胞增殖、凋亡或特定處理?xiàng)l件下（如氧化應(yīng)激或高糖環(huán)境），GAPDH的表達(dá)可能會波動，因此在這些情況下不適合作為內(nèi)參。
代謝活性相關(guān)：GAPDH涉及糖酵解過程，代謝狀態(tài)的變化可能影響其表達(dá)。
02、β-actin（β-肌動蛋白）
優(yōu)點(diǎn)
細(xì)胞骨架基因：β-actin編碼的是細(xì)胞骨架蛋白，在大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)量高且通常相對穩(wěn)定。
廣泛適用：類似于GAPDH，β-actin也是常用的內(nèi)參基因，廣泛適用于不同類型的細(xì)胞和組織。
缺點(diǎn)
表達(dá)波動：在細(xì)胞分裂、遷移或重塑過程中，β-actin的表達(dá)可能發(fā)生變化。在某些實(shí)驗(yàn)條件下，如在癌細(xì)胞或免疫細(xì)胞中，其表達(dá)也可能不穩(wěn)定。
偽基因存在：β-actin存在偽基因（非編碼的相似序列），可能在qPCR中導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
03、其他內(nèi)參基因
18S rRNA：作為核糖體RNA，18S rRNA通常在不同條件下高度表達(dá)且相對穩(wěn)定，適合大量RNA樣品的實(shí)驗(yàn)。但由于其高表達(dá)量，可能需要稀釋樣本才能與目標(biāo)基因保持在相同的線性范圍內(nèi)。
HPRT1（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1）：常用于癌癥研究和基因表達(dá)研究，其表達(dá)相對穩(wěn)定，但在某些組織中可能會有波動。
RPLP0（核糖體蛋白大亞基P0）：編碼核糖體蛋白，是另一種穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，廣泛應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)條件下。
04、選擇內(nèi)參基因的原則
表達(dá)穩(wěn)定性：內(nèi)參基因的表達(dá)應(yīng)該在所有實(shí)驗(yàn)條件下都穩(wěn)定。理想情況下，內(nèi)參基因的表達(dá)水平不受實(shí)驗(yàn)處理、細(xì)胞狀態(tài)或組織類型的影響。
適應(yīng)樣本類型：根據(jù)你研究的細(xì)胞類型或組織，選擇合適的內(nèi)參基因。例如，GAPDH和β-actin在多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，但在某些特殊條件下可能不適合。
多重內(nèi)參的使用：在許多情況下，使用多個內(nèi)參基因進(jìn)行規(guī)范化可以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。通過GeNorm或NormFinder等軟件可以評估多個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，從而選擇最佳的內(nèi)參組合。
應(yīng)用實(shí)例分享
利用 Archimed 進(jìn)行基因表達(dá)相對定量分析(△△Ct 法）
以下我們將以一個真實(shí)實(shí)驗(yàn)為例，展示利用 Archimed 定量 PCR 進(jìn)行基因表達(dá)相對定 量分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)以 HELA 細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材料，將 FOXCL2-M8 和 FOXCL2- M10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 HELA 細(xì)胞系， 目的是研究兩種質(zhì)粒對某信號通路上 IL2A、star-qpcr1 和 IER3 三個基因的表達(dá)影響，選用GAPDH 作為內(nèi)參基因。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，包括內(nèi)參在內(nèi)的四種基因，在 Archimed X6 上擴(kuò)增重復(fù)性和特異 性很好，CT 值的 SD 均≤0.1；在 HELA 細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入兩種質(zhì)粒后，IER3 和 IL2A 兩種基因 的表達(dá)均有下降，star-qpcr1基因的表達(dá)有上調(diào)。
擴(kuò)增曲線結(jié)果
熔解曲線結(jié)果
基因表達(dá)差異結(jié)果
總 結(jié)
常規(guī)實(shí)驗(yàn)：如果樣本類型和實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件較為常規(guī)，GAPDH或β-actin通常是首選。
復(fù)雜條件：在處理復(fù)雜實(shí)驗(yàn)條件或特殊樣本類型時，建議測試多個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，選擇表達(dá)最穩(wěn)定的基因。
使用多個內(nèi)參：為了確保qPCR數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，尤其是在結(jié)果非常關(guān)鍵的研究中，使用多個內(nèi)參基因進(jìn)行規(guī)范化是最佳實(shí)踐。
最終，內(nèi)參基因的選擇應(yīng)該基于實(shí)驗(yàn)的具體情況，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后再應(yīng)用于qPCR分析。
當(dāng)然，一次優(yōu)異的相對定量結(jié)果呈現(xiàn)，除了我們內(nèi)參基因選取外，還取決于我們的試劑性能和設(shè)備的選擇，就像我們鯤鵬基因的Archimed系列QPCR儀。
Archimed 系列
熒光定量PCR儀
Archimed 系列熒光定量PCR儀是鯤鵬基因汲取定量PCR技術(shù)發(fā)展之精華，由國際化資深技術(shù)團(tuán)隊匠心打造的全球首款時間分辨實(shí)時熒光定PCR系統(tǒng)?；诜颇鶢柾哥R的新型光路系統(tǒng)、專利的時間分辨信號采集技術(shù)及獨(dú)特的控溫技術(shù)，使Archimed具備更高的檢測靈敏度、更卓越的溫控準(zhǔn)確性和均一性、更便捷的操作流程，以及更全面的分析功能。同時，基于全球視野的產(chǎn)品設(shè)計理念及制造工藝，賦予Archimed國際水準(zhǔn)的優(yōu)異品質(zhì)。