產(chǎn)品背景
在細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)中，質(zhì)粒/Minicircle DNA是DNA疫苗產(chǎn)品的主要成分之一，同時(shí)也是病毒載體或非病毒載體細(xì)胞免疫療法的重要原料。在質(zhì)粒制備菌株的生產(chǎn)過(guò)程中，大部分都是利用大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵的，通過(guò)堿裂解反應(yīng)，可以純化得到DNA產(chǎn)品，但是在堿裂解反應(yīng)的過(guò)程中，大腸桿菌會(huì)有大量的RNA釋放出來(lái)，并隨機(jī)斷裂形成大小不一的RNA碎片。
生物制品中存在的RNA碎片會(huì)影響其生物學(xué)的活性，干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染表達(dá)效率；同時(shí)，RNA殘留也會(huì)激活細(xì)胞干擾素通路引發(fā)免疫反應(yīng)，對(duì)人體產(chǎn)生危害，因此需要建立RNA殘留的定量檢測(cè)方法，保證產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。
法規(guī)要求
《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版第三部人用基因治療制品總論中規(guī)定，應(yīng)建立基因治療制品物理數(shù)量和生物數(shù)量的含量檢測(cè)指標(biāo)，可以通過(guò)諸如總顆粒數(shù)、感染性滴度或感染性顆粒數(shù)、基因組DNA/RNA或質(zhì)粒DNA濃度等的檢測(cè)來(lái)確定含量。
2022年5月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心（CDE）發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品要學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中也明確指出需對(duì)生產(chǎn)工藝引入的工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞RNA等納入產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。
檢測(cè)方法
目前中國(guó)藥典2020版規(guī)定了三種殘留核酸檢測(cè)技術(shù)：DNA探針雜交法、熒光染色法、定量PCR法。其中定量PCR法通過(guò)熒光標(biāo)記的特異性探針，監(jiān)測(cè)體系中熒光數(shù)值的變化，即時(shí)反映特異性擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。熒光強(qiáng)度達(dá)閾值時(shí)，PCR循環(huán)數(shù)與起始模板量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，采用已知濃度DNA標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以測(cè)定外源DNA殘留量。測(cè)量結(jié)果靈敏度高特異性強(qiáng)。
鯤鵬基因自主研發(fā)的E.Coli總RNA殘留檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ┡涮子?E.coli RNA定量參考品，可快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)各種生物制品的中間品、半成品和成品中E.coli宿主細(xì)胞RNA殘留量。
產(chǎn)品特點(diǎn)
性能指標(biāo)
1 - 標(biāo)準(zhǔn)品線性
試劑盒線性范圍為：2.00×10-3pg/μL ~2.00×102pg/μL，R2=0.9997，擴(kuò)增效率為 93.40%，各濃度檢測(cè)值 CV<15%。
2 - 空白限
空白限的檢測(cè)均值為 7.34×10-5 pg /μL，空白限確定為不大于 5.48×10-4 pg /μL。
3 - 準(zhǔn)確性
分別取 100μL 濃度為 1×10-3pg /μL、1×10-1pg /μL、10pg /μL樣本進(jìn)行 3 次檢測(cè)，分析樣本回收率和 CV。對(duì)于不同濃度 DNA 樣本回收率均在 70%~130%之間，CV 均小于 15%。
4 - 重復(fù)性
重復(fù) 10 次檢測(cè) 2 pg /μL 和 2×10-2 pg /μL 的 E.coli RNA，CV 值<15%。
5 - 定量限
檢測(cè) 5×10-3pg /μL、2×10-3pg /μL、1×10-3pg /μL、2×10-4pg/μL E.coli RNA，2×10-3pg /μL 及以上濃度 10個(gè)重復(fù)孔的 CV 值<20%。綜上，E.coli 總 RNA 殘留檢測(cè)試劑盒的定量限可達(dá) 2×10-4pg/μL。
產(chǎn)品信息
